引言

细胞亚种群之间的差异往往具有生物上的重要意义(如T细胞、肿瘤亚种群等)。但是，传统的RT - PCR技术只能检测到种群的范围，无法对亚种群进行检测。

利用高通量单细胞RNA序列技术或者断开配对T细胞和B细胞结合点技术等，都需要单细胞的相关信息。通过RT - PCR技术，可以将这些单细胞发生混合反应，压缩后在油中封装形成液滴。每个液滴中都包含单细胞中进行微反应的扩增子。

白细胞必须通过封装，才能在对应的结合位点配对t细胞受体。下图显示了实验状态下，进行反应混合（如RT-PCR混合）相结合的细胞。

 

在这个典型实验中，经过反应混合（如RT-PCR混合），细胞结合并封装在滴油中。在冷冻PCR管中收集产生的微乳液，并将其转移到PCR机中。

为了将液滴与两个以上细胞的混合量达到最小，通常要进行细胞稀释。稀释后，一般1~10滴液滴中才包含一个细胞。不过，每个液滴中细胞的数量随时间是不断变化的。这是细胞密度超过缓冲区发生细胞沉淀的结果。通过使用密度介质（如Percoll或者Optiprep）调整细胞密度，我们使得细胞处于悬浮状态，最大限度地降低细胞沉降率，并以一定的速度控制液滴中细胞的数量，进行细胞封装。

一旦我们可以获取更多有关t细胞受体的信息，就可更深入的了解免疫反应。为此，需要将原生细胞配对的异质二聚体链断开。

一般来说，水滴中含有多细胞时需要降低细胞的浓度。否则，在上面的例子中，当液滴中含有两个T细胞时，很难确定细胞本身配对的异质二聚体的情况。通过降低液滴中细胞的数量，可以使样品中每10滴液滴中约含有一个细胞。当细胞密度大于缓冲区时，细胞会迅速发生沉积。

本文使用常见的密度离心介质（如Percoll™和Optiprep™），在不影响液滴形成的情况下，减少细胞的沉积，使得细胞封装稳定的维持在每10滴中含有1个细胞的数量。

材料和方法

首先是0.2µm注射器，作为过滤器用来过滤，防止纤维和尘埃阻塞芯片。过滤后的溶液中，细胞悬浮液的制备过程将不再进行过滤。其次是清洗系统，经过空气冲洗、水过虑、丙酮过滤等步骤。

细胞的稀释速度控制在每10滴液滴中含有1个细胞。准备1.5毫升的埃普多夫管，用以盛放悬浮液，并置于一个20毫升的P型泵贮存玻璃小瓶中。测试溶液中，每650µl溶液含有1个细胞(即1.5×106细胞/毫升)，约每10滴液滴中含有1个细胞。稀释液经过封装后，进行细胞浓度的计算和调整。最终，在1.5毫升的埃普多夫管中收集形成的微乳液。

其中一个试剂通道被密封连接器中对应的孔堵塞，使得反应混合物无法流经芯片。在这种情况下，将细胞悬浮液与另一流体以1:1的比例在芯片上混合。液滴产生速度为100Hz，水相流量为0.5µl/min。为简化计算，本文将绵羊的红细胞(红血球)封装在一个液滴孵化芯片上。显微照片为0.1ms曝光生成的宽型液滴孵化通道，计算液滴中含有的细胞量（如0，1，2）。

红细胞表面的密度为1.09~1.10 g / ml，将0.7µl羊血悬浮在纯DMEM中。利用69.2% 的Percoll™或28.1% 的Optiprep™将DMEM调整到1.09 g / ml。最终，悬浮液浓度与DMEM的比例为1:20。

结果

本实验的主要目的是检查该密度介质的性能。该密度介质在维持细胞悬浮和控制稳定的封装速度上的可操作性。研究密度介质与封装设备之间的相互作影响，确定稳定液滴的形成。这两种设备，Percoll™和Optiprep™，由于对细胞无毒害、低渗透性和粘度，通常用于密度梯度离心法。细胞被封装在一个产生40~60µm滴滴的50µm结节芯片上。

产生高均匀分散液滴的液滴系统中含有精细控制的反应混合液滴，使得反应或分析条件可重复性较高。从下图中看出，液滴的平均直径为56.6毫米，具有0.25毫米的标准偏差，对应着95µl的体积和1µl的标准体积偏差。接着，细胞在高均匀分散液滴的液滴系统中进行封装。

 

图中，(A)为细胞封装装置，该装置包括两个P型泵、流量计、芯片和相关的连接器。芯片是用白云石高速成像系统成像，由光学系统、显微镜和高速摄影机组成。(B)为测定液滴大小和频率的白云石液滴监控软件。

最初，细胞被封装在纯净的DMEM培养基中，没有任何密度介质，细胞封装速度为每10滴1个细胞，即约有8%(34/413)的水滴中含有1个细胞，约0.5%(2/413) 的水滴中含有2个细胞。但是，随着实验的进行，细胞开始在埃普多夫管的出口处沉积，使得整个油管的出口处细胞浓度增加。

实验中，使用Percoll™将悬浊液密度调整到1.09 g/ml。在1小时内，使用Percoll™并没有显著影响芯片上液滴的形成、稳定和维持。刚开始，约8%（32/380）的液滴中含有1个细胞。7分钟后，约7%（25/340）的液滴中含有1个细胞，不存在含有两个或两个以上细胞的液滴。30分钟后，约10%（35/351）的液滴中含有1个，约0.3%（1/351）的液滴中含有2个细胞。这表明，利用Percoll™调整细胞密度，可以将细胞处于稳定的悬浮状态，为细胞的统一封装提供保证。

Optiprep™(28.1%)也可以用来调整细胞悬液的浓度。使用Optiprep™后，液滴的形成并没有显著的变化，液滴在1小时内也会保持稳定。刚开始，约12%（44/360）的水滴中含有1个细胞开始，约0.3%（1/360）的液滴中含有2个细胞。15分钟后，约9.5%的水滴中含有1个细胞，约1.1%的水滴中含有2个细胞。30分钟后，约9%的液滴中含有1个细胞，不存在含有多个细胞的液滴。这表明，寻找与细胞密度匹配的介质，利用Optiprep™调整细胞悬浮液浓度，有助于细胞的封装。

 

上图所示为细胞的封装。(a)为细胞在液滴孵化芯片上的封装。芯片结节宽55µm，下游通道宽150µm。液滴直径大约57µm。细胞由箭头表示。(b)为密度匹配后的细胞沉积最低值。一个小时后，盐水中的血红细胞的(左管)有明显沉淀，而经过密度匹配的红细胞 (右管)仍处于悬浮状态。(c)为下游孵化通道的显微照片，用于计算液滴和细胞。细胞由箭头表示。(d)显示密度匹配对细胞封装率的影响。对于无密度匹配的悬浮液，15分钟后细胞/液滴的沉降速度增加，导致水滴中含有两个或两个以上的细胞。相比之下，使用Percoll™或Optiprep™的细胞/液滴的沉降速度减小，减少了细胞沉积。(e)表显示了一个运行周期的数据。

结论

由于需要从血样或者高通量细胞流体中断开原生配对的T细胞受体结合位点或抗体。因此，很难利用其他方式将单细胞封装在“微反应”液滴中进行大型分析。

在本实验中，使用氟表面活性剂Pico-Surf™和氟碳石油NovecTM 7500将细胞进行封装。石油/表面活性剂组合可以应用在PCR设备中，维持液滴在热循环中的稳定，通过与细胞进行密度匹配，确保细胞均匀、稳定以每10滴中含有1个细胞的速度进行封装。这使得细胞维持稳定的悬浮状态，减少细胞的沉积。实验采用两种无毒、低密度、低渗透性的密度离心介质 (Percoll™或Optiprep™)来进行密度匹配。

原则上，细胞在液滴中的分布为泊松分布，每个细胞进入结节的概率相互独立。因此，液滴中含有1个细胞与2个细胞的比例应该为2 / λ，λ是细胞/液滴的平均数量。如果λ= 0.1，那么液滴中含有1个细胞与2个细胞的比例应该是2/0.1 = 20。

很明显，Percoll™和Optiprep™并不显著影响液滴的形成或稳定。此外，当细胞封装密度不匹配时，细胞会迅速发生沉积，从而增加底部的细胞浓度以及液滴中含有的细胞数。一旦加入Percoll™或Optiprep™，细胞悬浮液处于稳定状态，细胞沉积减少，维持了封装细胞时细胞数量的稳定。

资讯来源：Dolomite Microfluidics。

 

新材料在线编译整理——翻译：陈琼    校正：摩天轮